Набор для подготовки биологических образцов

[iaia]

Уважаемому сообществу огромный привет! Очень жалко, что не сложилась на сайте "лаборатория №...", которая должна была заниматься разработкой протоколов для визуализации на СЭМ биологических образцов. Пришлось нам в ФГБНУ "НИИГБ" думать самим.

Подробно метод и протокол суправитального лантаноидного контрастирования будет изложен в последнем номере этого года журнала "Гены и клетки" (я очень надеюсь, что нас напечатают без отсрочки).

Кратко о нем можно прочитать тут http://bioree.ru

Отмечу, что продажа наборов жидкостей для пробоподготовки не происходит от жажды наживы нашего коллектива (в статье подробно расписан алгоритм приготовления р-ров), просто купить ч.д.а. хлориды РЗЭ маленькими партиями бывает не очень легко. Народ спрашивает, интересуется, а мы тихонечко отбиваем 5 кг.

Некоторое время назад я в "фотогалерею" этого рекламного листка залил картинки, получаемые нами после контрастирования (а вернее даже, более широко - подготовки) биологических тканей, клеток и даже небольших организмов целиком. Некоторые картинки вышли достаточно забавными. Хочется пообсуждать - к бою готов!

[iaia]

Никто не хочет критиковать...) Наверное, наши ширпотребные биологические увеличения (соизмеримые с оптикой) не котируются. Ладно, пусть повисит ветка с методикой на форуме - может кому-нибудь сгодится.

Так вот, если у кого-нибудь возникнет желание поснимать клетки предлагаемым образом, то могу поделиться опытом непосредственно съемки... Итак, вымочили Вы клеточки в р-ре хлорида неодима изотонической концентрации, промыли дистиллированной водой, обдули с поверхности.

Для визуализации внутренней (подповерхностной) структуры образца снимать надо в режиме детекции обратно-рассеянных электронов. Очень хорошо получается без напыления в низком вакууме на коротких рабочих отрезках 4-6 мм, или в высоком — с напылением углеродом прямо поверх подсушенных с поверхности «мокрых» клеток и тканей, но опять-таки на коротких дистанциях.
Я не физик по образованию, но мне кажется, что высокая контрастность и лучшее разрешение, достигаемые только на коротких WD, каким-то образом связаны с угловой апертурой пучка и геометрией объектов.

В объеме клетки весьма неравномерно распределены зоны, обеспечивающие различную интенсивность обратного рассеяния. Большая часть объема (цитоплазма) не предполагает высокой вероятности взаимодействия с электронами, пробеги в ней большие, иными словами она достаточно «прозрачна» для пучка. Напротив, редкие и компактные насыщенные лантаноидами (до химического контрастирования — кальцием) структуры рассеивают электроны весьма эффективно.
Контрастность клеточных структур при визуализации в BSE определяется соотношением их расстояния от поверхности и ускоряющего напряжения.

Толщина самых «ходовых» клеток, выращиваемых биотехнологами (кератоцитов, нейрональных, эпителиальных, ММСК), прошивается пучком при 20-25 кВ. Именно эти напряжения позволяют хорошо визуализировать структуру. Ниже два изображения одного и того же поля при 15 кВ и 23 кВ. Это жиииирный переросший монослой клеток лимбального эпителия человека на пластике. Ядро в этой клетке расположилось у ее нижней (дальней от наблюдателя) стенки, вокруг него — разуплотненная зона. Хорошо видно, что эффективно «дотянуться» до ядра удалось только при 23 кВ.

Возвращаясь к контрастированию — можно, конечно и не контрастировать. Но если кальций не заместить лантаноидом, то детектор будет работать в заметно некомфортном режиме. Картинка существенно хуже. Плюс к тому — клетки сохнут, ядра деформируются и т.п.

[Dan758]

Интересно.
А Лабораторию №2 предлагаю вынуть из небытия.
В личке предлагаю обсудить. Скайп еще более приветствуется.

[iaia]

Отлично! Надо сотрудничать, конечно! Пытаюсь связаться с Вами уже двое суток. Сначала через личку, но она из моего аккаунта работает как-то криво. потом отправил почту (тоже используя сервис сайта). Письмо (видимо) не дошло, как и ЛС.

[Dan758]

К сожалению, почта на сайте отказывается работать.
Напишу в эл.почту.

PS чтобы избежать утечки Ваших адресов к спамерам, уберите их из сообщения (правила форума).

[SlavaSEM]

А есть возможность показать две картинки до и после контрастирования?

[iaia]

Для Dan758: Адреса убрал. Спасибо!

Для SlavaSEM: Конечно! В понедельник буду на работе - загружу несколько пар (окрашивание/контроль). Один и тот же объект "до и после" - невозможно, ибо чтоб накушаться лантаноидов клетка (ткань) должна быть живой. Невозможно отснять объект без Ln-контрастирования, а затем его контрастировать.

[SlavaSEM]

Да Вы совершенно правы! Я имею ввиду хотя бы клетки одной культуры разделить на две части. Отснять одну часть без контрастирования, а другую с контрастированием. В принципе то что вы и написали (окрашивание/ контроль). И это здорово было бы посмотреть.

[Dan758]

[iaia]

Для Dan758: Мы тут год мучаемся, чтоб уйти от ненужных процедур фиксации, обезвоживания, и т.п. Придумываем методику, чтоб из операционной получить шмат мяса и через 20 минут уже смотреть его на скане. Хотим смотреть ткань на СЭМ в ее состоянии, максимально близком к тому состоянию в котором она была живой. Никакого осмия и прочей вредятины при пробоподготовке! Никаких вытяжек, ацетонов, спиртов и пожарных инспекторов. Вот в чем была сверхзадача. ))))

А зачем Вам обязательно понадобилась фиксация? Что-то покрасится пассивно, но информативность снизится.

Для SlavaSEM: Попросил клеточников нарастить культуру на пластике, попробую покрасить так, чтоб в поле зрения были сразу обе зоны контрастированная и нет. Так будет наиболее показательно. Думаю, к пятнице будет готово. А пока - несколько пар изображений "по мотивам биотехнологий", и одна - свежая съемка с контролем биоптата.

[iaia]

Эпителий при рецидивирующей эрозии роговицы, отобран соскабливанием. На первом фото - как он есть, на втором - после контрастирования хлоридом неодима. На первом изображении практически не видно структуры ткани (несмотря на выкрученную контрастность), на втором прекрасно визуализируются аномальные клеточные контакты, ядра клеток. Второе изображение настолько контрастное, что я даже уползать на съемку на короткой дистанции не стал.

[iaia]

Ну, вот! Пишет - допустимая квота достигнута - больше не хочет загружать картинки! Что делать?

[Dan758]

[iaia]

Первые попытки использовать лантаноиды в качестве контраста были предприняты именно на просвете. Некоторые структуры "красятся" и после фиксации. Более того - на мой взгляд, природа этого "окрашивания" даже более специфичная, чем у осмия.

См. фотку выше - яркие границы, это скорее всего замещение кальция неодимом в кадгерине, отвечающем за межклеточную механическую связь. Такие границы красятся и у фиксированных клеток (немного хуже). Зарубежные ребята (если надо - ссылку дам, когда найду) в 80-х прошлого столетия красили фиксированный эпителий нитратами лантаноидов и "лантаноидами в коллоидной форме". Последнее - что-то невнятное, но это на совести авторов. Так вот, на тонких срезах в просвете они получали изображение клеточных контактов, абсолютно аналогичное моим. Объясняли они хреново, типа - лантаноиды проваливаются в межклеточные "щели". На самом деле, там в этих "щелях" сидит обалденный белок кадгерин, на одну молекулу (вернее, пятичастную организационную структуру) которого приходится пять "поясков", акцептирующих по три атома кальция. Дальше просто 3Ca2+ <> 2Ln3+ . Получается очень красивая химическая конверсия, приводящая к очень мощному локальному насыщению межклеточных контактов лантаноидами.

Dan758, если у Вас именно просвет - основной инструмент, то можно такую тему обыграть. Получится - возьмете в соавторы

[iaia]

И ответьте, пожалуйста кто-нибудь: что делать с квотой по загружаемым на форум фоткам. А то как же я буду на вопросы отвечать? Мегабайт - это пожизненно?

[SlavaSEM]

Не знаю как обойти это ограничение. Можно тогда я Вас попрошу скинуть мне на почту это сравнение? А вот как остальным показать, этого пока не знаю.

[Blackcat]

Доброго времени суток, товарищи! Иван Новиков (он же iaia на форуме) придумал, как обойти квоту по загружаемым фоткам - подключить коллег
Собственно, я - из клеточников того же института и мы в тесном взаимодействии пытаемся разобраться, что же собственно у нас получается увидеть при контрастировании лантаноидами...
но, меньше, слов, выкладываю картинки.

[Blackcat]

вот еще мы наснимали - контроль/опыт
контрольные, правда приходилось снимать на предельных режимах микроскопа, чтобы получить хоть более-менее годное изображение...

[SlavaSEM]

Ну да, теперь видна разница! Отличные изображения! У меня коллега хочет у Вас заказать на несколько проб Ваш набор жидкостей для пробоподготовки! Как покрасит, тоже выложу что получилось

[iaia]

Для SlavaSEM: Спасибо, но... Нет, это не "отличные" изображения. Это изображения только для ответа на Ваш вопрос о контроле. А вот, например, такое изображение уже потребовало некоторых усилий при съемке, зато информативность у него существенно выше, и нам самим оно очень нравится:

Покрупнее тут: http://molbiol.ru/forums/uploads/post-56904-1444128022.jpg

Руководитель наших клеточников - Анастасия Суббот (она же Blackcat на форуме) эту картинку уже разместила на уважаемом биологическом ресурсе для обсуждения визуализируемых элементов с точки зрения клеточной биологии, но думаю что ссылка на нее и тут тоже будет уместна. Тут картинку можно пообсуждать с точки зрения сканирующей электронной микроскопии... или просто полюбоваться. Не клетка, а парусный фрегат!
Я нарочно не стал "задавливать" яркость фона в "фотошопе", как того требует эстетика. Было бы еще красивей, но так лучше видно, что клетка (МСК, или ММСК) сидит на пластике.