Автор |
Сообщение |
iaiaБывалый
Сообщения: 67 Зарегистрирован: 31.10.2014 Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
|
|
Добавлено: Пн 14 Сентябрь 2015 23:05 Заголовок сообщения: Набор для подготовки биологических образцов |
|
|
Уважаемому сообществу огромный привет! Очень жалко, что не сложилась на сайте "лаборатория №...", которая должна была заниматься разработкой протоколов для визуализации на СЭМ биологических образцов. Пришлось нам в ФГБНУ "НИИГБ" думать самим.
Подробно метод и протокол суправитального лантаноидного контрастирования будет изложен в последнем номере этого года журнала "Гены и клетки" (я очень надеюсь, что нас напечатают без отсрочки).
Кратко о нем можно прочитать тут http://bioree.ru
Отмечу, что продажа наборов жидкостей для пробоподготовки не происходит от жажды наживы нашего коллектива (в статье подробно расписан алгоритм приготовления р-ров), просто купить ч.д.а. хлориды РЗЭ маленькими партиями бывает не очень легко. Народ спрашивает, интересуется, а мы тихонечко отбиваем 5 кг.
Некоторое время назад я в "фотогалерею" этого рекламного листка залил картинки, получаемые нами после контрастирования (а вернее даже, более широко - подготовки) биологических тканей, клеток и даже небольших организмов целиком. Некоторые картинки вышли достаточно забавными. Хочется пообсуждать - к бою готов!
|
|
|
|
|
 |
iaiaБывалый
Сообщения: 67 Зарегистрирован: 31.10.2014 Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
|
|
Добавлено: Сб 19 Сентябрь 2015 01:18 Заголовок сообщения: |
|
|
Никто не хочет критиковать...) Наверное, наши ширпотребные биологические увеличения (соизмеримые с оптикой) не котируются. Ладно, пусть повисит ветка с методикой на форуме - может кому-нибудь сгодится.
Так вот, если у кого-нибудь возникнет желание поснимать клетки предлагаемым образом, то могу поделиться опытом непосредственно съемки... Итак, вымочили Вы клеточки в р-ре хлорида неодима изотонической концентрации, промыли дистиллированной водой, обдули с поверхности.
Для визуализации внутренней (подповерхностной) структуры образца снимать надо в режиме детекции обратно-рассеянных электронов. Очень хорошо получается без напыления в низком вакууме на коротких рабочих отрезках 4-6 мм, или в высоком — с напылением углеродом прямо поверх подсушенных с поверхности «мокрых» клеток и тканей, но опять-таки на коротких дистанциях.
Я не физик по образованию, но мне кажется, что высокая контрастность и лучшее разрешение, достигаемые только на коротких WD, каким-то образом связаны с угловой апертурой пучка и геометрией объектов.
В объеме клетки весьма неравномерно распределены зоны, обеспечивающие различную интенсивность обратного рассеяния. Большая часть объема (цитоплазма) не предполагает высокой вероятности взаимодействия с электронами, пробеги в ней большие, иными словами она достаточно «прозрачна» для пучка. Напротив, редкие и компактные насыщенные лантаноидами (до химического контрастирования — кальцием) структуры рассеивают электроны весьма эффективно.
Контрастность клеточных структур при визуализации в BSE определяется соотношением их расстояния от поверхности и ускоряющего напряжения.
Толщина самых «ходовых» клеток, выращиваемых биотехнологами (кератоцитов, нейрональных, эпителиальных, ММСК), прошивается пучком при 20-25 кВ. Именно эти напряжения позволяют хорошо визуализировать структуру. Ниже два изображения одного и того же поля при 15 кВ и 23 кВ. Это жиииирный переросший монослой клеток лимбального эпителия человека на пластике. Ядро в этой клетке расположилось у ее нижней (дальней от наблюдателя) стенки, вокруг него — разуплотненная зона. Хорошо видно, что эффективно «дотянуться» до ядра удалось только при 23 кВ.
Возвращаясь к контрастированию — можно, конечно и не контрастировать. Но если кальций не заместить лантаноидом, то детектор будет работать в заметно некомфортном режиме. Картинка существенно хуже. Плюс к тому — клетки сохнут, ядра деформируются и т.п.
Описание: |
Монослой клеток лимбального эпителия человека на пластике. EVO LS10, BSE, лантаноидный контраст, 15 кВ, EP70 Па |
|
Размер файла: |
127.13 KB |
Просмотрено: |
259 раз(а) |

|
Описание: |
Монослой клеток лимбального эпителия человека на пластике. EVO LS10, BSE, лантаноидный контраст, 23 кВ, EP70 Па |
|
Размер файла: |
125.67 KB |
Просмотрено: |
272 раз(а) |

|
|
|
|
|
|
 |
Dan758Дед
Сообщения: 1276 Зарегистрирован: 28.01.2004 Откуда: Челябинск
|
|
Добавлено: Пн 21 Сентябрь 2015 11:06 Заголовок сообщения: |
|
|
Интересно.
А Лабораторию №2 предлагаю вынуть из небытия.
В личке предлагаю обсудить. Скайп еще более приветствуется.
_________________ Цапу надо было крутить! Цапу! (c)
"Я не профессионал, я широко и раскованно мыслящий дилетант" (c)
|
|
|
|
|
 |
iaiaБывалый
Сообщения: 67 Зарегистрирован: 31.10.2014 Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
|
|
Добавлено: Ср 23 Сентябрь 2015 22:18 Заголовок сообщения: |
|
|
Отлично! Надо сотрудничать, конечно! Пытаюсь связаться с Вами уже двое суток. Сначала через личку, но она из моего аккаунта работает как-то криво. потом отправил почту (тоже используя сервис сайта). Письмо (видимо) не дошло, как и ЛС.
Последний раз редактировалось: iaia (Чт 24 Сентябрь 2015 22:21), всего редактировалось 1 раз
|
|
|
|
|
 |
Dan758Дед
Сообщения: 1276 Зарегистрирован: 28.01.2004 Откуда: Челябинск
|
|
Добавлено: Чт 24 Сентябрь 2015 08:09 Заголовок сообщения: |
|
|
К сожалению, почта на сайте отказывается работать.
Напишу в эл.почту.
PS чтобы избежать утечки Ваших адресов к спамерам, уберите их из сообщения (правила форума).
_________________ Цапу надо было крутить! Цапу! (c)
"Я не профессионал, я широко и раскованно мыслящий дилетант" (c)
|
|
|
|
|
 |
SlavaSEMНовенький
Сообщения: 12 Зарегистрирован: 19.12.2014
|
|
Добавлено: Чт 24 Сентябрь 2015 15:48 Заголовок сообщения: |
|
|
А есть возможность показать две картинки до и после контрастирования?
|
|
|
|
|
 |
iaiaБывалый
Сообщения: 67 Зарегистрирован: 31.10.2014 Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
|
|
Добавлено: Чт 24 Сентябрь 2015 22:31 Заголовок сообщения: |
|
|
Для Dan758: Адреса убрал. Спасибо!
Для SlavaSEM: Конечно! В понедельник буду на работе - загружу несколько пар (окрашивание/контроль). Один и тот же объект "до и после" - невозможно, ибо чтоб накушаться лантаноидов клетка (ткань) должна быть живой. Невозможно отснять объект без Ln-контрастирования, а затем его контрастировать.
|
|
|
|
|
 |
SlavaSEMНовенький
Сообщения: 12 Зарегистрирован: 19.12.2014
|
|
Добавлено: Пт 25 Сентябрь 2015 09:22 Заголовок сообщения: |
|
|
Да Вы совершенно правы! Я имею ввиду хотя бы клетки одной культуры разделить на две части. Отснять одну часть без контрастирования, а другую с контрастированием. В принципе то что вы и написали (окрашивание/ контроль). И это здорово было бы посмотреть.
|
|
|
|
|
 |
Dan758Дед
Сообщения: 1276 Зарегистрирован: 28.01.2004 Откуда: Челябинск
|
|
Добавлено: Пн 28 Сентябрь 2015 12:42 Заголовок сообщения: |
|
|
iaia писал(а): |
ибо чтоб накушаться лантаноидов клетка (ткань) должна быть живой. Невозможно отснять объект без Ln-контрастирования |
У-упс... Получается, на фиксированных образцах методика не работает?
_________________ Цапу надо было крутить! Цапу! (c)
"Я не профессионал, я широко и раскованно мыслящий дилетант" (c)
|
|
|
|
|
 |
iaiaБывалый
Сообщения: 67 Зарегистрирован: 31.10.2014 Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
|
|
Добавлено: Пн 28 Сентябрь 2015 16:34 Заголовок сообщения: |
|
|
Для Dan758: Мы тут год мучаемся, чтоб уйти от ненужных процедур фиксации, обезвоживания, и т.п. Придумываем методику, чтоб из операционной получить шмат мяса и через 20 минут уже смотреть его на скане. Хотим смотреть ткань на СЭМ в ее состоянии, максимально близком к тому состоянию в котором она была живой. Никакого осмия и прочей вредятины при пробоподготовке! Никаких вытяжек, ацетонов, спиртов и пожарных инспекторов. Вот в чем была сверхзадача. ))))
А зачем Вам обязательно понадобилась фиксация? Что-то покрасится пассивно, но информативность снизится.
Для SlavaSEM: Попросил клеточников нарастить культуру на пластике, попробую покрасить так, чтоб в поле зрения были сразу обе зоны контрастированная и нет. Так будет наиболее показательно. Думаю, к пятнице будет готово. А пока - несколько пар изображений "по мотивам биотехнологий", и одна - свежая съемка с контролем биоптата.
|
|
|
|
|
 |
iaiaБывалый
Сообщения: 67 Зарегистрирован: 31.10.2014 Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
|
|
Добавлено: Пн 28 Сентябрь 2015 16:43 Заголовок сообщения: |
|
|
Эпителий при рецидивирующей эрозии роговицы, отобран соскабливанием. На первом фото - как он есть, на втором - после контрастирования хлоридом неодима. На первом изображении практически не видно структуры ткани (несмотря на выкрученную контрастность), на втором прекрасно визуализируются аномальные клеточные контакты, ядра клеток. Второе изображение настолько контрастное, что я даже уползать на съемку на короткой дистанции не стал.
Описание: |
|
Размер файла: |
126.44 KB |
Просмотрено: |
262 раз(а) |

|
Описание: |
|
Размер файла: |
125.83 KB |
Просмотрено: |
296 раз(а) |

|
|
|
|
|
|
 |
iaiaБывалый
Сообщения: 67 Зарегистрирован: 31.10.2014 Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
|
|
Добавлено: Пн 28 Сентябрь 2015 16:58 Заголовок сообщения: |
|
|
Ну, вот! Пишет - допустимая квота достигнута - больше не хочет загружать картинки! Что делать?
|
|
|
|
|
 |
Dan758Дед
Сообщения: 1276 Зарегистрирован: 28.01.2004 Откуда: Челябинск
|
|
Добавлено: Ср 30 Сентябрь 2015 08:06 Заголовок сообщения: |
|
|
iaia писал(а): |
Придумываем методику, чтоб из операционной получить шмат мяса и через 20 минут уже смотреть его на скане. Хотим смотреть ткань на СЭМ в ее состоянии, максимально близком к тому состоянию в котором она была живой. Никакого осмия и прочей вредятины при пробоподготовке! Никаких вытяжек, ацетонов, спиртов и пожарных инспекторов. Вот в чем была сверхзадача. ))))
А зачем Вам обязательно понадобилась фиксация? Что-то покрасится пассивно, но информативность снизится.
|
Сверхзадача, конечно, похвальная. На скане решаемая, на просвете - вряд ли.
_________________ Цапу надо было крутить! Цапу! (c)
"Я не профессионал, я широко и раскованно мыслящий дилетант" (c)
|
|
|
|
|
 |
iaiaБывалый
Сообщения: 67 Зарегистрирован: 31.10.2014 Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
|
|
Добавлено: Ср 30 Сентябрь 2015 22:50 Заголовок сообщения: |
|
|
Первые попытки использовать лантаноиды в качестве контраста были предприняты именно на просвете. Некоторые структуры "красятся" и после фиксации. Более того - на мой взгляд, природа этого "окрашивания" даже более специфичная, чем у осмия.
См. фотку выше - яркие границы, это скорее всего замещение кальция неодимом в кадгерине, отвечающем за межклеточную механическую связь. Такие границы красятся и у фиксированных клеток (немного хуже). Зарубежные ребята (если надо - ссылку дам, когда найду) в 80-х прошлого столетия красили фиксированный эпителий нитратами лантаноидов и "лантаноидами в коллоидной форме". Последнее - что-то невнятное, но это на совести авторов. Так вот, на тонких срезах в просвете они получали изображение клеточных контактов, абсолютно аналогичное моим. Объясняли они хреново, типа - лантаноиды проваливаются в межклеточные "щели". На самом деле, там в этих "щелях" сидит обалденный белок кадгерин, на одну молекулу (вернее, пятичастную организационную структуру) которого приходится пять "поясков", акцептирующих по три атома кальция. Дальше просто 3Ca2+ <> 2Ln3+ . Получается очень красивая химическая конверсия, приводящая к очень мощному локальному насыщению межклеточных контактов лантаноидами.
Dan758, если у Вас именно просвет - основной инструмент, то можно такую тему обыграть. Получится - возьмете в соавторы
|
|
|
|
|
 |
iaiaБывалый
Сообщения: 67 Зарегистрирован: 31.10.2014 Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
|
|
Добавлено: Ср 30 Сентябрь 2015 22:56 Заголовок сообщения: |
|
|
И ответьте, пожалуйста кто-нибудь: что делать с квотой по загружаемым на форум фоткам. А то как же я буду на вопросы отвечать? Мегабайт - это пожизненно?
|
|
|
|
|
 |
SlavaSEMНовенький
Сообщения: 12 Зарегистрирован: 19.12.2014
|
|
Добавлено: Пт 02 Октябрь 2015 10:31 Заголовок сообщения: |
|
|
Не знаю как обойти это ограничение. Можно тогда я Вас попрошу скинуть мне на почту это сравнение? А вот как остальным показать, этого пока не знаю.
|
|
|
|
|
 |
BlackcatНовенький
Сообщения: 2 Зарегистрирован: 02.10.2015
|
|
Добавлено: Пт 02 Октябрь 2015 21:18 Заголовок сообщения: |
|
|
Доброго времени суток, товарищи! Иван Новиков (он же iaia на форуме) придумал, как обойти квоту по загружаемым фоткам - подключить коллег
Собственно, я - из клеточников того же института и мы в тесном взаимодействии пытаемся разобраться, что же собственно у нас получается увидеть при контрастировании лантаноидами...
но, меньше, слов, выкладываю картинки.
Описание: |
Пытались покрасить так, чтобы в кадр вошли и покрашенные и нет. красили капелькой на монослой ммск. сверху - некрашенные, снизу - крашенные, посередине - граница раздела. |
|
Размер файла: |
124.5 KB |
Просмотрено: |
292 раз(а) |

|
|
|
|
|
|
 |
BlackcatНовенький
Сообщения: 2 Зарегистрирован: 02.10.2015
|
|
Добавлено: Сб 03 Октябрь 2015 09:05 Заголовок сообщения: |
|
|
вот еще мы наснимали - контроль/опыт
контрольные, правда приходилось снимать на предельных режимах микроскопа, чтобы получить хоть более-менее годное изображение...
Описание: |
контрольный образец - культура 4t1 - мышиный рак молочной железы, тут кроме как сказать, где ядро, а где цитоплазма, вроде как и нечего... |
|
Размер файла: |
123.66 KB |
Просмотрено: |
291 раз(а) |

|
Описание: |
контрастированный лантаноидами образец - культура 4t1 - мышиный рак молочной железы, цитоархитектоника видна вроде, ядра, ядрышки, тяжики, псевдоподии... |
|
Размер файла: |
125.84 KB |
Просмотрено: |
287 раз(а) |

|
|
|
|
|
|
 |
SlavaSEMНовенький
Сообщения: 12 Зарегистрирован: 19.12.2014
|
|
Добавлено: Сб 03 Октябрь 2015 10:14 Заголовок сообщения: |
|
|
Ну да, теперь видна разница! Отличные изображения! У меня коллега хочет у Вас заказать на несколько проб Ваш набор жидкостей для пробоподготовки! Как покрасит, тоже выложу что получилось
|
|
|
|
|
 |
iaiaБывалый
Сообщения: 67 Зарегистрирован: 31.10.2014 Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
|
|
Добавлено: Вт 06 Октябрь 2015 22:46 Заголовок сообщения: |
|
|
Для SlavaSEM: Спасибо, но... Нет, это не "отличные" изображения. Это изображения только для ответа на Ваш вопрос о контроле. А вот, например, такое изображение уже потребовало некоторых усилий при съемке, зато информативность у него существенно выше, и нам самим оно очень нравится:
Покрупнее тут: http://molbiol.ru/forums/uploads/post-56904-1444128022.jpg
Руководитель наших клеточников - Анастасия Суббот (она же Blackcat на форуме) эту картинку уже разместила на уважаемом биологическом ресурсе для обсуждения визуализируемых элементов с точки зрения клеточной биологии, но думаю что ссылка на нее и тут тоже будет уместна. Тут картинку можно пообсуждать с точки зрения сканирующей электронной микроскопии... или просто полюбоваться. Не клетка, а парусный фрегат!
Я нарочно не стал "задавливать" яркость фона в "фотошопе", как того требует эстетика. Было бы еще красивей, но так лучше видно, что клетка (МСК, или ММСК) сидит на пластике.
|
|
|
|
|
 |
|
|
|