Начало div  FAQ  div  Поиск  div  Пользователи  div  Группы  div  Избранное  div  Регистрация  div  Вход 
Список форумов Microscopist.ru arrow РЭМ (Методы) arrow Набор для подготовки биологических образцов

Набор для подготовки биологических образцов
На страницу 1, 2, 3  След.
Начать новую тему   Ответить на темуОтветить
Автор Сообщение
iaia
Бывалый

Сообщения: 67
Зарегистрирован: 31.10.2014
Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
СообщениеДобавлено: Пн 14 Сентябрь 2015 23:05    Заголовок сообщения: Набор для подготовки биологических образцов Ответить с цитатой

Уважаемому сообществу огромный привет! Очень жалко, что не сложилась на сайте "лаборатория №...", которая должна была заниматься разработкой протоколов для визуализации на СЭМ биологических образцов. Пришлось нам в ФГБНУ "НИИГБ" думать самим.

Подробно метод и протокол суправитального лантаноидного контрастирования будет изложен в последнем номере этого года журнала "Гены и клетки" (я очень надеюсь, что нас напечатают без отсрочки).

Кратко о нем можно прочитать тут http://bioree.ru

Отмечу, что продажа наборов жидкостей для пробоподготовки не происходит от жажды наживы нашего коллектива (в статье подробно расписан алгоритм приготовления р-ров), просто купить ч.д.а. хлориды РЗЭ маленькими партиями бывает не очень легко. Народ спрашивает, интересуется, а мы тихонечко отбиваем 5 кг. Smile

Некоторое время назад я в "фотогалерею" этого рекламного листка залил картинки, получаемые нами после контрастирования (а вернее даже, более широко - подготовки) биологических тканей, клеток и даже небольших организмов целиком. Некоторые картинки вышли достаточно забавными. Хочется пообсуждать - к бою готов!
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail Посетить сайт автора
iaia
Бывалый

Сообщения: 67
Зарегистрирован: 31.10.2014
Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
СообщениеДобавлено: Сб 19 Сентябрь 2015 01:18    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Никто не хочет критиковать...) Наверное, наши ширпотребные биологические увеличения (соизмеримые с оптикой) не котируются. Ладно, пусть повисит ветка с методикой на форуме - может кому-нибудь сгодится.

Так вот, если у кого-нибудь возникнет желание поснимать клетки предлагаемым образом, то могу поделиться опытом непосредственно съемки... Итак, вымочили Вы клеточки в р-ре хлорида неодима изотонической концентрации, промыли дистиллированной водой, обдули с поверхности.

Для визуализации внутренней (подповерхностной) структуры образца снимать надо в режиме детекции обратно-рассеянных электронов. Очень хорошо получается без напыления в низком вакууме на коротких рабочих отрезках 4-6 мм, или в высоком — с напылением углеродом прямо поверх подсушенных с поверхности «мокрых» клеток и тканей, но опять-таки на коротких дистанциях.
Я не физик по образованию, но мне кажется, что высокая контрастность и лучшее разрешение, достигаемые только на коротких WD, каким-то образом связаны с угловой апертурой пучка и геометрией объектов.

В объеме клетки весьма неравномерно распределены зоны, обеспечивающие различную интенсивность обратного рассеяния. Большая часть объема (цитоплазма) не предполагает высокой вероятности взаимодействия с электронами, пробеги в ней большие, иными словами она достаточно «прозрачна» для пучка. Напротив, редкие и компактные насыщенные лантаноидами (до химического контрастирования — кальцием) структуры рассеивают электроны весьма эффективно.
Контрастность клеточных структур при визуализации в BSE определяется соотношением их расстояния от поверхности и ускоряющего напряжения.

Толщина самых «ходовых» клеток, выращиваемых биотехнологами (кератоцитов, нейрональных, эпителиальных, ММСК), прошивается пучком при 20-25 кВ. Именно эти напряжения позволяют хорошо визуализировать структуру. Ниже два изображения одного и того же поля при 15 кВ и 23 кВ. Это жиииирный переросший монослой клеток лимбального эпителия человека на пластике. Ядро в этой клетке расположилось у ее нижней (дальней от наблюдателя) стенки, вокруг него — разуплотненная зона. Хорошо видно, что эффективно «дотянуться» до ядра удалось только при 23 кВ.

Возвращаясь к контрастированию — можно, конечно и не контрастировать. Но если кальций не заместить лантаноидом, то детектор будет работать в заметно некомфортном режиме. Картинка существенно хуже. Плюс к тому — клетки сохнут, ядра деформируются и т.п.



15.jpg
 Описание:
Монослой клеток лимбального эпителия человека на пластике. EVO LS10, BSE, лантаноидный контраст, 15 кВ, EP70 Па
 Размер файла:  127.13 KB
 Просмотрено:  243 раз(а)

15.jpg



23.jpg
 Описание:
Монослой клеток лимбального эпителия человека на пластике. EVO LS10, BSE, лантаноидный контраст, 23 кВ, EP70 Па
 Размер файла:  125.67 KB
 Просмотрено:  253 раз(а)

23.jpg


Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail Посетить сайт автора
Dan758
Дед

Сообщения: 1276
Зарегистрирован: 28.01.2004
Откуда: Челябинск
СообщениеДобавлено: Пн 21 Сентябрь 2015 11:06    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Интересно.
А Лабораторию №2 предлагаю вынуть из небытия.
В личке предлагаю обсудить. Скайп еще более приветствуется.

_________________
Цапу надо было крутить! Цапу! (c)
"Я не профессионал, я широко и раскованно мыслящий дилетант" (c)
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail ICQ Number
iaia
Бывалый

Сообщения: 67
Зарегистрирован: 31.10.2014
Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
СообщениеДобавлено: Ср 23 Сентябрь 2015 22:18    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Отлично! Надо сотрудничать, конечно! Пытаюсь связаться с Вами уже двое суток. Сначала через личку, но она из моего аккаунта работает как-то криво. потом отправил почту (тоже используя сервис сайта). Письмо (видимо) не дошло, как и ЛС.

Последний раз редактировалось: iaia (Чт 24 Сентябрь 2015 22:21), всего редактировалось 1 раз
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail Посетить сайт автора
Dan758
Дед

Сообщения: 1276
Зарегистрирован: 28.01.2004
Откуда: Челябинск
СообщениеДобавлено: Чт 24 Сентябрь 2015 08:09    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

К сожалению, почта на сайте отказывается работать.
Напишу в эл.почту.

PS чтобы избежать утечки Ваших адресов к спамерам, уберите их из сообщения (правила форума).

_________________
Цапу надо было крутить! Цапу! (c)
"Я не профессионал, я широко и раскованно мыслящий дилетант" (c)
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail ICQ Number
SlavaSEM
Новенький

Сообщения: 12
Зарегистрирован: 19.12.2014
СообщениеДобавлено: Чт 24 Сентябрь 2015 15:48    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

А есть возможность показать две картинки до и после контрастирования?
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение
iaia
Бывалый

Сообщения: 67
Зарегистрирован: 31.10.2014
Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
СообщениеДобавлено: Чт 24 Сентябрь 2015 22:31    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Для Dan758: Адреса убрал. Спасибо!

Для SlavaSEM: Конечно! В понедельник буду на работе - загружу несколько пар (окрашивание/контроль). Один и тот же объект "до и после" - невозможно, ибо чтоб накушаться лантаноидов клетка (ткань) должна быть живой. Невозможно отснять объект без Ln-контрастирования, а затем его контрастировать.
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail Посетить сайт автора
SlavaSEM
Новенький

Сообщения: 12
Зарегистрирован: 19.12.2014
СообщениеДобавлено: Пт 25 Сентябрь 2015 09:22    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Да Вы совершенно правы! Я имею ввиду хотя бы клетки одной культуры разделить на две части. Отснять одну часть без контрастирования, а другую с контрастированием. В принципе то что вы и написали (окрашивание/ контроль). И это здорово было бы посмотреть.
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение
Dan758
Дед

Сообщения: 1276
Зарегистрирован: 28.01.2004
Откуда: Челябинск
СообщениеДобавлено: Пн 28 Сентябрь 2015 12:42    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

iaia писал(а):
ибо чтоб накушаться лантаноидов клетка (ткань) должна быть живой. Невозможно отснять объект без Ln-контрастирования

У-упс... Получается, на фиксированных образцах методика не работает?

_________________
Цапу надо было крутить! Цапу! (c)
"Я не профессионал, я широко и раскованно мыслящий дилетант" (c)
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail ICQ Number
iaia
Бывалый

Сообщения: 67
Зарегистрирован: 31.10.2014
Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
СообщениеДобавлено: Пн 28 Сентябрь 2015 16:34    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Для Dan758: Мы тут год мучаемся, чтоб уйти от ненужных процедур фиксации, обезвоживания, и т.п. Придумываем методику, чтоб из операционной получить шмат мяса и через 20 минут уже смотреть его на скане. Хотим смотреть ткань на СЭМ в ее состоянии, максимально близком к тому состоянию в котором она была живой. Никакого осмия и прочей вредятины при пробоподготовке! Никаких вытяжек, ацетонов, спиртов и пожарных инспекторов. Вот в чем была сверхзадача. ))))

А зачем Вам обязательно понадобилась фиксация? Что-то покрасится пассивно, но информативность снизится.

Для SlavaSEM: Попросил клеточников нарастить культуру на пластике, попробую покрасить так, чтоб в поле зрения были сразу обе зоны контрастированная и нет. Так будет наиболее показательно. Думаю, к пятнице будет готово. А пока - несколько пар изображений "по мотивам биотехнологий", и одна - свежая съемка с контролем биоптата.
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail Посетить сайт автора
iaia
Бывалый

Сообщения: 67
Зарегистрирован: 31.10.2014
Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
СообщениеДобавлено: Пн 28 Сентябрь 2015 16:43    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Эпителий при рецидивирующей эрозии роговицы, отобран соскабливанием. На первом фото - как он есть, на втором - после контрастирования хлоридом неодима. На первом изображении практически не видно структуры ткани (несмотря на выкрученную контрастность), на втором прекрасно визуализируются аномальные клеточные контакты, ядра клеток. Второе изображение настолько контрастное, что я даже уползать на съемку на короткой дистанции не стал.


рэ неокр.jpg
 Описание:
 Размер файла:  126.44 KB
 Просмотрено:  242 раз(а)

рэ неокр.jpg



рэ окраш.jpg
 Описание:
 Размер файла:  125.83 KB
 Просмотрено:  280 раз(а)

рэ окраш.jpg


Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail Посетить сайт автора
iaia
Бывалый

Сообщения: 67
Зарегистрирован: 31.10.2014
Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
СообщениеДобавлено: Пн 28 Сентябрь 2015 16:58    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Ну, вот! Пишет - допустимая квота достигнута - больше не хочет загружать картинки! Что делать?
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail Посетить сайт автора
Dan758
Дед

Сообщения: 1276
Зарегистрирован: 28.01.2004
Откуда: Челябинск
СообщениеДобавлено: Ср 30 Сентябрь 2015 08:06    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

iaia писал(а):
Придумываем методику, чтоб из операционной получить шмат мяса и через 20 минут уже смотреть его на скане. Хотим смотреть ткань на СЭМ в ее состоянии, максимально близком к тому состоянию в котором она была живой. Никакого осмия и прочей вредятины при пробоподготовке! Никаких вытяжек, ацетонов, спиртов и пожарных инспекторов. Вот в чем была сверхзадача. ))))

А зачем Вам обязательно понадобилась фиксация? Что-то покрасится пассивно, но информативность снизится.


Сверхзадача, конечно, похвальная. На скане решаемая, на просвете - вряд ли.

_________________
Цапу надо было крутить! Цапу! (c)
"Я не профессионал, я широко и раскованно мыслящий дилетант" (c)
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail ICQ Number
iaia
Бывалый

Сообщения: 67
Зарегистрирован: 31.10.2014
Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
СообщениеДобавлено: Ср 30 Сентябрь 2015 22:50    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Первые попытки использовать лантаноиды в качестве контраста были предприняты именно на просвете. Некоторые структуры "красятся" и после фиксации. Более того - на мой взгляд, природа этого "окрашивания" даже более специфичная, чем у осмия.

См. фотку выше - яркие границы, это скорее всего замещение кальция неодимом в кадгерине, отвечающем за межклеточную механическую связь. Такие границы красятся и у фиксированных клеток (немного хуже). Зарубежные ребята (если надо - ссылку дам, когда найду) в 80-х прошлого столетия красили фиксированный эпителий нитратами лантаноидов и "лантаноидами в коллоидной форме". Последнее - что-то невнятное, но это на совести авторов. Так вот, на тонких срезах в просвете они получали изображение клеточных контактов, абсолютно аналогичное моим. Объясняли они хреново, типа - лантаноиды проваливаются в межклеточные "щели". На самом деле, там в этих "щелях" сидит обалденный белок кадгерин, на одну молекулу (вернее, пятичастную организационную структуру) которого приходится пять "поясков", акцептирующих по три атома кальция. Дальше просто 3Ca2+ <> 2Ln3+ . Получается очень красивая химическая конверсия, приводящая к очень мощному локальному насыщению межклеточных контактов лантаноидами.

Dan758, если у Вас именно просвет - основной инструмент, то можно такую тему обыграть. Получится - возьмете в соавторы Wink
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail Посетить сайт автора
iaia
Бывалый

Сообщения: 67
Зарегистрирован: 31.10.2014
Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
СообщениеДобавлено: Ср 30 Сентябрь 2015 22:56    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

И ответьте, пожалуйста кто-нибудь: что делать с квотой по загружаемым на форум фоткам. А то как же я буду на вопросы отвечать? Мегабайт - это пожизненно?
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail Посетить сайт автора
SlavaSEM
Новенький

Сообщения: 12
Зарегистрирован: 19.12.2014
СообщениеДобавлено: Пт 02 Октябрь 2015 10:31    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Не знаю как обойти это ограничение. Можно тогда я Вас попрошу скинуть мне на почту это сравнение? А вот как остальным показать, этого пока не знаю.
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение
Blackcat
Новенький

Сообщения: 2
Зарегистрирован: 02.10.2015
СообщениеДобавлено: Пт 02 Октябрь 2015 21:18    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Доброго времени суток, товарищи! Иван Новиков (он же iaia на форуме) придумал, как обойти квоту по загружаемым фоткам - подключить коллег Smile
Собственно, я - из клеточников того же института и мы в тесном взаимодействии пытаемся разобраться, что же собственно у нас получается увидеть при контрастировании лантаноидами...
но, меньше, слов, выкладываю картинки.



2in1.jpg
 Описание:
Пытались покрасить так, чтобы в кадр вошли и покрашенные и нет. красили капелькой на монослой ммск. сверху - некрашенные, снизу - крашенные, посередине - граница раздела.
 Размер файла:  124.5 KB
 Просмотрено:  274 раз(а)

2in1.jpg


Посмотреть профиль Отправить личное сообщение
Blackcat
Новенький

Сообщения: 2
Зарегистрирован: 02.10.2015
СообщениеДобавлено: Сб 03 Октябрь 2015 09:05    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

вот еще мы наснимали - контроль/опыт
контрольные, правда приходилось снимать на предельных режимах микроскопа, чтобы получить хоть более-менее годное изображение...



4t1_pure_2.jpg
 Описание:
контрольный образец - культура 4t1 - мышиный рак молочной железы, тут кроме как сказать, где ядро, а где цитоплазма, вроде как и нечего...
 Размер файла:  123.66 KB
 Просмотрено:  272 раз(а)

4t1_pure_2.jpg



4t1_Nd_2.jpg
 Описание:
контрастированный лантаноидами образец - культура 4t1 - мышиный рак молочной железы, цитоархитектоника видна вроде, ядра, ядрышки, тяжики, псевдоподии...
 Размер файла:  125.84 KB
 Просмотрено:  270 раз(а)

4t1_Nd_2.jpg


Посмотреть профиль Отправить личное сообщение
SlavaSEM
Новенький

Сообщения: 12
Зарегистрирован: 19.12.2014
СообщениеДобавлено: Сб 03 Октябрь 2015 10:14    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Ну да, теперь видна разница! Отличные изображения! У меня коллега хочет у Вас заказать на несколько проб Ваш набор жидкостей для пробоподготовки! Как покрасит, тоже выложу что получилось Smile
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение
iaia
Бывалый

Сообщения: 67
Зарегистрирован: 31.10.2014
Откуда: Москва, ФГБНУ "НИИГБ"
СообщениеДобавлено: Вт 06 Октябрь 2015 22:46    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Для SlavaSEM: Спасибо, но... Нет, это не "отличные" изображения. Это изображения только для ответа на Ваш вопрос о контроле. А вот, например, такое изображение уже потребовало некоторых усилий при съемке, зато информативность у него существенно выше, и нам самим оно очень нравится:

Покрупнее тут: http://molbiol.ru/forums/uploads/post-56904-1444128022.jpg

Руководитель наших клеточников - Анастасия Суббот (она же Blackcat на форуме) эту картинку уже разместила на уважаемом биологическом ресурсе для обсуждения визуализируемых элементов с точки зрения клеточной биологии, но думаю что ссылка на нее и тут тоже будет уместна. Тут картинку можно пообсуждать с точки зрения сканирующей электронной микроскопии... или просто полюбоваться. Не клетка, а парусный фрегат!
Я нарочно не стал "задавливать" яркость фона в "фотошопе", как того требует эстетика. Было бы еще красивей, но так лучше видно, что клетка (МСК, или ММСК) сидит на пластике.
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail Посетить сайт автора
Показать сообщения:   
Начать новую тему   Ответить на темуОтветить
Страница 1 из 3 На страницу 1, 2, 3  След.


о проекте || новости || публикации || оборудование || события
фотогалерея
|| форум || спонсоры || ссылки

©2002 - Microscopist.ru - портал микроскопистов
:главная :контакты :карта сайта :faq :помощь Rambler's Top100 Рейтинг@Mail.ru
Powered by phpBB © 2001-2003 phpBB Group | Часовой пояс: GMT + 3